مقدمه ای بر میکروسکوپ کانفوکال

میکروسکوپ کانفوکال چندین مزیت نسبت به میکروسکوپ نوری واید فیلد معمولی ارائه می دهد ، از جمله:

• توانایی کنترل عمق میدان
• حذف یا کاهش اطلاعات پس زمینه به دور از صفحه کانونی (عواملی که منجر به تخریب تصویر می شوند)
• قابلیت جمع آوری بخش های نوری سریال از نمونه های ضخیم

اشاره کرد. کلید اصلی رویکرد متداول استفاده از تکنیک های فیلتر فضایی برای از بین بردن نور یا تابش خیره کننده خارج از کانون در نمونه هایی است که ضخامت آنها از سطح فوکوس فوری(immediate plane of focus) بیشتر است.

در سالهای اخیر محبوبیت میکروسکوپ کانفوکال همچون یک انفجار عظیم بوده است ، این محبوبیت تا حدی به دلیل سهولت نسبی تهیه تصاویر با کیفیت بسیار بالا از نمونه های تهیه شده برای میکروسکوپ فلورسانس معمولی و افزایش تعداد کاربردها در زیست شناسی سلولی، که به تصویربرداری از سلول ها و بافت های ثابت و زنده متکی هستند. در حقیقت ، ثابت شده است که فن آوری کانفوکال یکی از مهمترین پیشرفتها در فن آوری میکروسکوپ های نوری است.

                                       شکل ۱

در یک میکروسکوپ نوری اپیدوم فلورسانس (epi-fluorescence) میدان وسیع (widefield) ، فلورسانس ثانویه ساطع شده توسط نمونه اغلب از طریق حجم برانگیخته و تفکیک پذیری ویژگی هایی که در صفحه کانونی لنز شیئی (objective focal plane) قرار دارند ، پنهان می شود. این مسئله با نمونه های ضخیم تر (بیشتر از ۲ میکرومتر) ، که معمولاً درجه انتشار فلورسانس بالای از خود نشان می دهند و به همین خاطر بیشتر جزئیات ریز از بین می رود. حتی اگر رزولوشن با میکروسکوپ کانفوکال نسبت به تکنیک های متداول میدان گسترده تا حدی افزایش یافته باشد ، اما هنوز هم به میزان قابل توجهی کمتر از انتقال داده های تصویری میکروسکوپ الکترونی است.

در شکل ۱ مجموعه ای از تصاویر ارائه شده است که میادین دید انتخاب شده در میکروسکوپ میدان روشن کلاسیک و میکروسکوپ کنفوکال اسکن لیزری را با یکدیگر مقایسه می کنند. یک قسمت ضخیم از مدولای انسان لکه دار فلورسنت در فلورسانس میدان گسترده (widefield) ، مقدار زیادی تابش خیره کننده از ساختارهای فلورسنت بالا و پایین صفحه کانونی را به نمایش می گذارد (شکل ۱ (a)). هنگام تصویربرداری با میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری (شکل ۱ (d)) ، قسمت ضخیم مدولا درجه قابل توجهی از جزئیات ساختاری را نشان می دهد. به همین ترتیب ، تصویربرداری فلورسانس میدان گسترده از الیاف عضلانی خرگوش که با فلورسئین آغشته شده اند ، تصاویر تار (شکل ۱ (b)) را با جزئیات کم ایجاد می کند ، در حالی که همان میدان نمونه (شکل ۱ (e)) توپوگرافی بسیاری از رشته ها  را در میکروسکوپ کانفوکال نشان می دهد. فلورسانس در یک دانه گرده آفتابگردان یک طرح کلی نامشخص از مورفولوژی اولیه خارجی ایجاد می کند (شکل ۱ (c)) ، اما هیچ نشانه ای از ساختار داخلی مشاهده نمی شود. در مقابل ، یک قسمت نوری نازک از همان دانه (شکل ۱ (f)) به دست آمده با تکنیک های کانونی ، تفاوت چشمگیری بین هسته ذرات و پوشش اطراف نشان می دهد.

جهت استعلام قیمت میکروسکوپ با ما تماس بگیرید

چشم انداز تاریخی

مفهوم اساسی میکروسکوپ کانفوکال در ابتدا توسط ماروین مینسکی (Marvin Minsky ) در اواسط دهه ۱۹۵۰ (ثبت اختراع در سال ۱۹۵۷) زمانی که وی دانشجوی فوق دکترا در دانشگاه هاروارد بود ، ایجاد شد. مینسکی می خواست از شبکه های عصبی در آماده سازی های رنگ آمیزی نشده بافت مغز تصویربرداری کند و تمایل به تصویربرداری از رویدادهای بیولوژیکی در هنگام وقوع آنها در سیستم های زنده داشت.

مینسکی می خواست از شبکه های عصبی در آماده سازی های رنگ آمیزی نشده بافت مغز تصویربرداری کند و تمایل به تصویربرداری از رویدادهای بیولوژیکی در هنگام وقوع آنها در سیستم های زنده داشت. اختراع مینسکی تا حد زیادی مورد توجه قرار نگرفت ، به احتمال زیاد به دلیل کمبود منابع نور شدید لازم برای تصویربرداری و قدرت پردازش کامپیوتر برای کنترل مقدار زیادی داده.

به دنبال کار مینسکی ، M. David Egger و Mojmir Petran در اواخر دهه ۱۹۶۰ یک میکروسکوپ کانفوکال چند پرتو ساختند که از دیسک چرخان (Nipkow) برای بررسی بخشهای مغزی لکه دار و سلولهای گانگلیونی استفاده می کرد. اگر (Egger) در ادامه این عرصه ، اولین میکروسکوپ لیزری کانفوکال اسکن شده مکانیکی را تولید کرد و اولین تصاویر قابل شناسایی از سلول ها را در سال ۱۹۷۳ منتشر کرد. در اواخر دهه ۱۹۷۰ و ۱۹۸۰ ، پیشرفت در کامپیوتر و فناوری لیزر ، همراه با الگوریتم های جدید دیجیتال دستکاری تصاویر ، منجر به افزایش علاقه به میکروسکوپ کانفوکال می شود.

خوشبختانه ، اندکی پس از انقضا امتیاز حق اختراع مینسکی ، طرح های میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری توسط چندین محقق به ابزار کار عملی تبدیل شد. فیزیکدان هلندی جی. فرد براکنهف (G. Fred Brakenhoff) در سال ۱۹۷۹ میکروسکوپ کانفیوکال روبشی را توسعه داد ، در حالی که تقریبا به طور همزمان ، کالین شپارد (Colin Sheppard) با یک تئوری شکل گیری تصویر به این روش کمک کرد. تونی ویلسون (Tony Wilson) ، برد آموس (Brad Amos) و جان وایت (John White) این مفهوم را پرورش دادند و بعداً (در اواخر دهه ۱۹۸۰) کاربرد تصویربرداری کانفوکال را در بررسی نمونه های بیولوژیکی فلورسنت نشان دادند.

اولین ابزارهای تجاری در سال ۱۹۸۷ ظاهر شد. در طی دهه ۱۹۹۰ ، پیشرفت در زمینه اپتیک و الکترونیک لیزرهای پایدارتر و قدرتمندتری ، واحدهای آینه اسکن با کارای بالا ، فیبرهای نوری با توان بالا ، پوشش های بهتر دی الکتریک فیلم نازک و آشکارسازهایی را که دارای ویژگی های نویز کاهش یافته را فراهم می کند. علاوه بر این ، فلوروکروم هایی که با دقت بیشتری با خطوط برانگیخته لیزر مطابقت داشتند ، شروع به سنتز می شوند. همراه با سرعت پردازش رایانه ای که به سرعت در حال پیشرفت است ، نمایشگرهای پیشرفته و فناوری ذخیره سازی اطلاعات با حجم زیاد که در اواخر دهه ۱۹۹۰ ظهور می کند ، مرحله ای برای یک انفجار مجازی در تعداد برنامه هایی که می تواند با میکروسکوپ کانفیکال اسکن لیزر مورد هدف قرار داد، فراهم شد.

میکروسکوپ های کانفوکال مدرن را می توان به عنوان سیستم های الکترونیکی کاملاً یکپارچه ای در نظر گرفت که میکروسکوپ نوری نقش اصلی را در پیکربندی متشکل از یک یا چند ردیاب الکترونیکی ، رایانه (برای نمایش تصویر ، پردازش ، خروجی و ذخیره سازی) و چندین سیستم لیزر همراه با دستگاه های انتخاب طول موج و یک مجموعه اسکن پرتو، دارد. در بیشتر موارد ، ادغام بین اجزای مختلف به قدری کامل است که از کل میکروسکوپ کانفوکال به طور کلی به عنوان یک سیستم تصویربرداری دیجیتال یا ویدئو یاد می شود که قادر به تولید تصاویر الکترونیکی است. این میکروسکوپ ها اکنون برای تحقیقات معمول روی مولکول ها ، سلول ها و بافت های زنده استفاده می شوند که حتی چند سال پیش امکان پذیر نبودند.

اصول میکروسکوپ کانفوکال

اصل کانفوکال در میکروسکوپ اسکن لیزر اپی- فلورسانس به  صورت نمودار در شکل ۲ ارائه شده است. نور منسجمی که توسط سیستم لیزر (منبع برانگیختن لیزر، Laser Excitation Source) ساطع می شود از یک دیافراگم سوراخ سوراخ (Light Source Pinhole Aperture) عبور می کند که در یک صفحه مزدوج قرار دارد (کانونی، Confocal) با یک نقطه اسکن روی نمونه و یک دیافراگم سوراخ سوراخ دوم  (Detector Pinhole Aperture) که در جلوی آشکارساز قرار گرفته است.(یک تیوب افزاینده نوری). همانطور که لیزر توسط یک آینه دو رنگ  (Dichromatic Mirror) منعکس شده و از سراسر نمونه در یک صفحه کانونی مشخص اسکن می شود. فلورسانس ثانویه ساطع شده از نقاط روی نمونه (در همان صفحه کانونی) از طریق آینه دو رنگ عبور می کند و به عنوان یک نقطه کانونی در دهانه سوراخ سوراخ آشکارساز متمرکز می شود.

                                 شکل ۲

جهت خرید میکروسکوپ با ما تماس بگیرید

مقدار قابل توجهی از انتشار فلورسانس که در نقاط بالا و پایین صفحه کانونی شیئی اتفاق می افتد با دیافراگم سوراخ سوراخ ، کانونی نیست. (اشعه های نور خارج از کانون در شکل ۲ نامیده می شود، Out-of-Focus Light Rays ) و دیسک های بادی بلند را در صفحه دهانه تشکیل می دهد. از آنجا که تنها بخش کوچکی از انتشار فلورسانس خارج از فوکوس از طریق دیافراگم سوراخ سوراخ تحویل می شود ، بیشتر این نور اضافی توسط دستگاها فزاینده نوری تشخیص داده نمی شود و به تصویر حاصل کمک نمی کند. زیرا تنها بخش کوچکی از انتشار فلورسانس خارج از کانون با عبور از درون دیافراگم سوراخ سوراخ نجات داده میشود، بیشتر این نور اضافی توسط دستگاه افزاینده نوری تشخیص داده نمی شود و به تشکیل تصویر حاصل کمک نمی کند. آینه دو رنگ ، فیلتر مانع (Barrier Filter) و فیلتر برانگیختن (excitation filter) عملکردهای مشابه اجزای یکسان را در میکروسکوپ اپی-فلورسانس (epi-fluorescence) میدان وسیع انجام می دهند. فکوس مجدد لنز شئی در میکروسکوپ کانفوکال ، نقاط بانگیخته و انتشار را در یک نمونه به صفحه جدیدی منتقل می کند که با دیافراگم سوراخ سوراخ سوراخ منبع نور و آشکارساز مخلوط می شود.

در میکروسکوپ سنتی میدان فلورسانس میدان روشن (widefield) ، کل نمونه تحت تابش شدید یک لامپ غیر قوسی جیوه ای یا تخلیه قوس زنون قرار می گیرد و تصویر حاصل از انتشار فلورسانس ثانویه را می توان مستقیماً در چشمی ها مشاهده کرد یا بر روی سطح یک آشکارساز آرایه الکترونیکی یا صفحه فیلم کلاسیک قرار داد. در مقابل این مفهوم ساده ، سازوکار تشکیل تصویر در میکروسکوپ کانفوکال اساساً متفاوت است. همانطور که در بالا بحث شد ، میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال شامل چندین منبع برانگیختن لیزر ، یک هد اسکن با اجزای نوری و الکترونیکی ، آشکارسازهای الکترونیکی (معمولاً افزاینده های نوری) و یک کامپیوتر برای ثبت ، پردازش ، تجزیه و تحلیل و نمایش تصاویر است.

هد اسکن در قلب سیستم کانونی (confocal) قرار دارد و وظیفه رستر زدن (صفحه ای کردن، تبدیل اطلاعات تصویری به بیت های دیجیتال)اسکن های برانگیخته و همچنین جمع آوری سیگنال های فوتونی از نمونه را دارد که برای ایجاد تصویر نهایی مورد نیاز است. یک هد اسکن معمولی شامل ورودی از منابع لیزر خارجی ، مجموعه فیلترهای فلورسانس و آینه های دو رنگ ، سیستم آینه اسکن شطرنجی مبتنی بر گالوانومتر ، دیافراگم سوراخ سوراخ متغیر برای تولید تصویر کانفوکال ، و آشکارسازهای لوله فوتومولتیپلایر (افزاینده نور) تنظیم شده برای طول موج های مختلف فلورسانس است. ترتیب کلی اجزای هد اسکن در شکل ۳ برای یک واحد تجاری معمولی ارائه شده است.

                                       شکل ۳

در میکروسکوپ کانفوکال اسکن روشنایی اپی-روشنایی (epi-illumination)، آشکارسازهای منبع نور لیزر و دستگاه افزاینده نوری هر دو توسط لنز شیئی از هم جدا می شوند ، که به عنوان یک مخزن اصلاح شده کندانسور و ترکیب با لنز شیئی عمل میکند. اجزای فیلتر داخلی فلورسانس (مانند فیلترهای برانگیختگی و مسدود کننده و آینه های دو رنگ ، such as the excitation and barrier filters and the dichromatic mirrors ) و فیلترهای چگالی خنثی ( یا فیلترهای کاهنده نور ) در واحد اسکن موجود هستند (شکل ۳ را ببینید). فیلترهای تداخل و چگالی خنثی در ستون های چرخان یا متحرک قرار دارند که می توانند توسط اپراتور در مسیر نور قرار گیرند. پرتوی لیزر برانگیخته با یک اتصال دهنده فیبر نوری و به دنبال آن یک افزاینده (منبسط کننده) پرتو که پرتو لیزر نازک را قادر می سازد دهانه پشت لنز شیئی را کاملا پر کند (یک الزام مهم در میکروسکوپ کانفوکال) به واحد اسکن متصل می شود. نور لیزر منبسط شده که از درون لنز شیئی میکروسکوپ عبور می کند ، یک نقطه شدید در محدوده پراش تشکیل می دهد که توسط آینه های گالوانومتر متصل شده در یک الگوی شطرنجی در سطح نمونه اسکن می شود (اسکن نقطه ای).

یکی از مهمترین اجزای واحد اسکن ، دیافراگم سوراخ سوراخ است که به عنوان یک فیلتر فضایی در صفحه تصویر مزدوج واقع در مقابل دستگاه افزاینده نور عمل می کند. چندین دیافراگم با قطر متفاوت معمولاً روی برجک چرخان وجود دارد که اپراتور را قادر می سازد اندازه سوراخ سوراخ (و ضخامت بخش نوری) را تنظیم کند. فلورسانس ثانویه جمع شده توسط لنز شیئی به کمک همان آینه های گالوانومتری که الگوی شطرنجی را تشکیل می دهند ، اسکن می شود و قبل از رسیدن به دیافراگم سوراخ سوراخ از طریق یک فیلتر جدا ساز عبور می کند. دیافراگم به کار رفته برای حذف کردن سیگنال های فلورسانس خارج از مسیر فکوس ( غیر کانونی )، که از دیگر اجزا در بالا و پایین صفحه کانونی ( Focal Plane ) منتشر میشود، جایگزین برنامه ریزی شده اند که برروی دیفراگم به عنوان Airy دیسک های دارای قطر خیلی بیشتر از آنهای که تصویر را تشکیل می دهند ، است. این دیسک های بزرگ در یک فضای نسبتاً بزرگی پخش شده اند ، به طوری که فقط بخش کوچکی از نوری که در صفحه دور از نقطه کانونی منشا می گیرد از دیافراگم عبور می کند. دیافراگم سوراخ سوراخ همچنین برای از بین بردن بسیاری از نورهای سرگردان که از سیستم نوری عبور می کنند ، عمل می کند. اسکن کردن با اتصال نقطه دیافراگم محدود (aperture-limited point) به یک فیلتر فضایی سوراخ سوراخ در صفحه تصویر مزدوج از ویژگی های اساسی میکروسکوپ کانفوکال است.

هنگام تقابل شباهت ها و تفاوت های بین میکروسکوپ های واید فیلد و میکروسکوپ های کانفوکال، مقایسه ویژگی و هندسه نور نمونه ای که برای هر یک از تکنیک ها به کار رفته ، بسیار مفید است. لنز های شیئی میکروسکوپ فلورسانس واید فیلد کلاسیک یک مخروط گسترده ای از نور را بر حجم زیادی از نمونه متمرکز می کند ، که به طور یکنواخت و همزمان روشن می شود (همانطور که در شکل ۴ (a) نشان داده شده است). اکثر انتشار فلورسانس که به سمت میکروسکوپ برمی گردد توسط لنز شیئی جمع می شود (بسته به دیافراگم عددی) و در لنز های چشمی یا آشکارساز قرار می گیرد. نتیجه مقدار قابل توجهی سیگنال است که به دلیل نور پس زمینه ساطع شده و فلورسانس خودکار از مناطق بالا و پایین صفحه کانونی منشا می گیرند ، که وضوح و کنتراست تصویر را به طور جدی کاهش می دهد.

                                           شکل ۴

منبع روشنایی لیزر در میکروسکوپ کانفوکال ابتدا برای متراکم کردن نور  دیافراگم پشت شیئی گسترش یافته و سپس توسط سیستم لنز به یک نقطه بسیار کوچک در صفحه کانونی متمرکز می شود (شکل ۴ (ب)). اندازه نقطه روشنایی تقریباً از ۰٫۲۵ تا ۰٫۸ میکرومتر قطر (بسته به دیافراگم عددی هدف) و ۰٫۵ تا ۱٫۵ میکرومتر عمق با درخشان ترین شدت متغیر است. اندازه نقطه کانفوکال با طراحی میکروسکوپ ، طول موج نور لیزر حادثه ای ، ویژگی های هدف ، تنظیمات واحد اسکن و نمونه تعیین می شود. در شکل ۴ مقایسه ای بین مخروط های روشنایی معمولی یک میکروسکوپ واید فیلد (شکل ۴ (الف)) و میکروسکوپ اسکن نقطه ای (شکل ۴ (ب)) در همان دیافراگم عددی ارائه شده است. کل عمق نمونه در یک منطقه وسیع توسط میکروسکوپ واید فیلد روشن می شود ، در حالی که نمونه با یک نقطه روشنایی با تمرکز دقیق در مرکز صفحه کانونی در میکروسکوپ کانفوکال اسکن می شود.

در میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری ، با نمونه برداری از پرتو متمرکز در یک نطقه مشخص در یک الگوی شطرنجی کنترل شده توسط دو آینه نوسان با سرعت بالا که توسط موتور گالوانومتر انجام می شود ، تصویر یک نمونه گسترده تولید می شود. یکی از آینه ها پرتو را از چپ به راست در امتداد محور جانبی x حرکت می دهد ، در حالی که دیگری پرتو را در جهت y ترجمه می کند. پس از هر بار اسکن در امتداد محور x ، پرتو به سرعت به نقطه آغازین منتقل شده و در امتداد محور y جابجا می شود تا اسکن جدیدی را در فرآیندی با عنوان بازگشت به عقب آغاز کند. در طی عملیات برگشت ، اطلاعات تصویر جمع آوری نمی شود. به این روش ، ناحیه مورد نظر روی نمونه در یک صفحه کانونی توسط نور لیزر برانگیخته شده از واحد اسکن، اسکن می شود.

جهت مشاهده محصول مرتبط اینجا کلیک کنید

جهت مطاله برنامه های کاربردی میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری اینجا کلیک کنید

تعمیرات تخضصی انواع تجهیزات پزشکی و آزمایشگاهی از جمله تعمیرات میکروسکوپ در این مرکز انجام میشود