راهنمای اساسی Real Time PCR در تشخیص میکروبی

Real Time PCR (کمی PCR، qPCR) در حال حاضر یک روش کاملاً تثبیت شده برای تشخیص، تعیین کمیت و شناسایی عوامل میکروبی مختلف در حوزه‌های تشخیص بالینی ، دامپزشکی و ایمنی مواد غذایی است. اگرچه مفهوم PCR نسبتاً ساده است، اما مسائل خاصی در qPCR وجود دارد که توسعه دهندگان و کاربران این فناوری باید در نظر داشته باشند. این مسائل عبارتند از : استفاده از اصطلاحات و تعاریف صحیح، درک اصل PCR، مشکلات در تفسیر و ارائه داده ها، محدودیت های qPCR در حوزه های مختلف تشخیص میکروبی و پارامترهای مهم برای توصیف عملکرد qPCR. هدف ما در این بررسی توصیف تک تک جنبه‌های طراحی، بهینه‌سازی و اعتبار qPCR نیست. با این حال، امیدواریم این مقاله به راهنمایی مبتدیان و کاربران qPCR در استفاده از این تکنیک قدرتمند کمک کند.

 

معرفی

عبارت “واکنش زنجیره ای پلیمراز” (PCR) برای اولین بار بیش از ۳۰ سال پیش در مقاله ای که یک تقویت آنزیمی جدید DNA را توصیف می کرد استفاده شد (سایکی و همکاران، ۱۹۸۵). اولین کاربردهای PCR به دلیل استفاده از قطعه Klenow حساس به حرارت برای تکثیر، که باید بعد از هر مرحله دناتوراسیون به واکنش اضافه می شد، غیرعملی بود. نوآوری مهمی که استفاده روتین از PCR را امکان پذیر کرد، استفاده از پلیمراز مقاوم در برابر حرارت از Thermus aquaticus بود (Saiki et al., 1988). این پیشرفت، همراه با در دسترس بودن سیکلرهای PCR و اجزای شیمیایی، منجر به شناخت جهانی PCR به عنوان ابزار انتخابی برای تکثیر آنزیمی خاص DNA در شرایط آزمایشگاهی شد. لازم به ذکر است که مفهوم کلی PCR که شامل پرایمرها، DNA پلیمراز، نوکلئوتیدها، یونهای خاص ، الگوی DNA و شامل چرخه هایی است که مراحل دناتوراسیون DNA، بازپخت پرایمر و گسترش آن را شامل میشود، از سال ۱۹۸۵ تغییر نکرده است. اختراع PCR تحقیقات در زمینه های مختلف زیست شناسی را بسیار تقویت کرده است و این فناوری به میزان قابل توجهی به سطح دانش فعلی بشر در بسیاری از حوزه های تحقیقاتی کمک کرده است.

مهم ترین نقطه عطف در استفاده از PCR، معرفی مفهوم نظارت بر تقویت DNA در زمان واقعی از طریق نظارت بر فلورسانس بود (هولند و همکاران، ۱۹۹۱؛ هیگوچی و همکاران، ۱۹۹۲). PCR در زمان واقعی  (همچنین به عنوان PCR کمی – qPCR مشخص می شود؛ استفاده از RT-PCR نامناسب است زیرا این مخفف به PCR رونویسی معکوس اختصاص داده شده است)، فلورسانس پس از هر چرخه اندازه گیری می شود و شدت سیگنال فلورسنت مقدار لحظه ای آمپلیکون های DNA در نمونه را در آن زمان خاص منعکس می کند. در چرخه های اولیه، فلورسانس آنقدر کم است که از پس زمینه قابل تشخیص نیست. با این حال، نقطه ای که در آن شدت فلورسانس بالاتر از سطح قابل تشخیص افزایش می یابد، متناسب با تعداد اولیه مولکول های DNA الگو در نمونه است. این نقطه چرخه کمی نامیده می شود (Cq؛ تولیدکنندگان مختلف ابزارهای qPCR از اصطلاحات خاص خود استفاده می کنند، اما از سال ۲۰۰۹، اصطلاح Cq به طور انحصاری استفاده می شود) و امکان تعیین مقدار مطلق DNA هدف در نمونه را با توجه به منحنی کالیبراسیون ساخته شده از نمونه های استاندارد رقیق شده سریال (معمولاً رقت های اعشاری) با غلظت های شناخته شده یا اعداد کپی (یانگ و روتمن، ۲۰۰۴؛ کوبیستا و همکاران، ۲۰۰۶؛ بوستین و همکاران، ۲۰۰۹)

علاوه بر این، qPCR همچنین می‌تواند نتایج نیمه کمی را بدون استانداردها اما با کنترل‌هایی که به عنوان ماده مرجع استفاده می‌شوند، ارائه دهد. در این مورد، نتایج مشاهده شده را می توان به صورت مضربی بالاتر یا پایین تر با اشاره به کنترل بیان کرد. این کاربرد qPCR به طور گسترده برای مطالعات بیان ژن استفاده شده است (Bustin et al., 2009)، اما موفقیت یکسانی را در کمی سازی میکروبیولوژی به دست نیاورد زیرا قادر به تولید مقادیر کمی مطلق نیست.

دو استراتژی برای تجسم زمان واقعی قطعات DNA تقویت شده وجود دارد – رنگ‌های فلورسنت غیر اختصاصی DNA و پروب‌های الیگونوکلئوتیدی نشان‌دار شده با فلورسنت. این دو رویکرد به طور موازی توسعه داده شدند (هولند و همکاران، ۱۹۹۱؛ هیگوچی و همکاران، ۱۹۹۲) و در تشخیص پاتوژن استفاده می شوند. با این حال، شیمی مبتنی بر کاوشگر غالب است. این به دلیل ویژگی بالاتر آن است که توسط اولیگونوکلئوتید اضافی – پروب – و حساسیت کمتر برای شناسایی محصولات غیر اختصاصی PCR، به عنوان مثال، دایمرهای پرایمر انجام می شود (Bustin, 2000؛ Kubista et al., 2006).

برای درک کامل امکانات qPCR در تشخیص و تعیین کمیت DNA هدف در نمونه ها، توصیف اصل ریاضی این روش ضروری است. PCR یک فرآیند نمایی است که در آن تعداد مولکول های DNA به طور نظری پس از هر چرخه دو برابر می شود (اگر بازده واکنش ۱۰۰٪ باشد). به طور کلی، واکنش تقویت از این معادله پیروی می کند:

که در آن Nn تعداد آمپلیکون‌های PCR پس از n چرخه، N0 تعداد اولیه کپی‌های الگو در نمونه، E بازده PCR است که می‌تواند مقادیری را در محدوده ۰ تا ۱ (۰-۱۰۰%) فرض کند و n عدد است. از چرخه ها در سناریویی که ابتدا یک کپی از الگو در واکنش وجود دارد و راندمان PCR 100٪ است، می توان معادله را به صورت زیر ساده کرد:

اگر منحنی کالیبراسیون اجرا شود، معمولاً از رقت های سریالی ۱۰ برابر استفاده می شود. تفاوت در مقادیر Cq بین دو رقت سریال ۱۰ برابر می تواند به زیر صورت بیان شود:

سپس n = 3.322 است. وقتی E باید تعیین شود (۱) که نقطه شروع باشد و معادله بشکل زیر در می آید:

اگر n 3.322 در نظر گرفته شود، E = 1، یعنی ۱۰۰% است.

بنابراین، کارایی PCR یک عامل مهم برای تعیین کمیت DNA هدف در نمونه‌های ناشناخته است. سپس قابلیت اطمینان منحنی کالیبراسیون در تعیین کمیت با فاصله رقت‌های سریال تعیین می‌شود. اگر Log10 غلظت یا تعداد کپی هر استاندارد در برابر مقدار Cq آن رسم شود (شکل ۱)، E را می توان از معادله رگرسیونی که تابع خطی را توصیف می کند استخراج کرد:

در جایی که x و y، غلظت/مقدار هدف و Cq به ترتیب مختصات را در نمودار مشخص می‌کنند، k ضریب یا شیب رگرسیون و c نقطه قطع است. با گرفتن معادله رگرسیون مدل از شکل ۱، شیب ۳٫۳۲۲- است، که به این معنی است که E = 100٪ مطابق ( ۴). رهگیری مقدار Cq را زمانی نشان می دهد که یک نسخه از نظر تئوری شناسایی شود (کوبیستا و همکاران، ۲۰۰۶؛ جانسون و همکاران، ۲۰۱۳). سپس غلظت یا مقدار اسید نوکلئیک هدف در نمونه های ناشناخته با توجه به مقدار Cq از طریق رابطه (۵) محاسبه می شود.

از تعاریف بالا مشخص می شود که مقادیر Cq قرائت های ابزاری هستند و باید مجدداً به مقادیر با واحدهای خاص محاسبه شوند، به عنوان مثال، کپی های ارگانیسم، نانوگرم DNA، غلظت های مختلف و غیره، (Bustin et al., 2009; Johnson et al. همکاران، ۲۰۱۳). با این حال، ارجاع به مقادیر Cq در مقالات علمی گسترده است و تفاسیر مبتنی بر مقادیر Cq می‌تواند منجر به نتایج گمراه‌کننده شود. غلظت در qPCR در مقیاس لگاریتمی بیان می شود (شکل ۱) و تفاوت های Cq بین رقت های سریال ۱۰ برابر از نظر تئوری همیشه ۳٫۳۲۲ سیکل است. بنابراین، اگرچه تفاوت عددی بین Cq 20 و ۳۵ نسبتاً ناچیز است، تفاوت در اعداد واقعی (کپی، ng) تقریباً پنج مرتبه بزرگی است (Log10).

این ویژگی باید در محاسبات بعدی منعکس شود. به عنوان مثال، ضریب تغییرات (CV، نسبت بین انحراف استاندارد و میانگین) محاسبه شده از مقادیر Cq و اعداد واقعی نتایج کاملاً متفاوتی را به همراه دارد. همین امر برای هر آزمون آماری که از مقادیر Cq استفاده می شود، صدق می کند، حتی برای مواردی که از لگاریتم مقادیر Cq برای نرمال سازی داده ها قبل از ارزیابی آماری استفاده می شود. روش صحیح باید شامل محاسبه مجدد اولیه به اعداد واقعی و به دنبال آن تبدیل لگاریتمی باشد.

 

مزایا و معایب استفاده از qPCR در تشخیص و تعیین کمیت عوامل بیماری زا

از آنجایی که PCR قادر به تکثیر قطعه خاصی از DNA است، در تشخیص پاتوژن استفاده است. با افزایش مقدار داده های توالی یابی موجود، به معنای واقعی کلمه امکان طراحی سنجش qPCR برای هر میکروارگانیسم (گروه ها و زیر گروه های میکروارگانیسم ها و غیره) وجود دارد. مزایای اصلی qPCR این است که تشخیص سریع و با توان بالا و تعیین کمیت توالی های DNA هدف در ماتریس های مختلف را فراهم می کند. زمان کمتر تقویت با تقویت و تجسم همزمان آمپلیکون های DNA تازه تشکیل شده تسهیل می شود. علاوه بر این، qPCR از نظر جلوگیری از آلودگی های متقابل ایمن تر است زیرا پس از تقویت، نیازی به دستکاری بیشتر با نمونه ها نیست. سایر مزایای qPCR شامل محدوده دینامیکی گسترده برای کمی سازی (۷-۸ Log10) و چندگانه سازی تقویت چندین هدف در یک واکنش واحد است (Klein, 2002). گزینه مالتی پلکس برای تشخیص و تعیین کمیت در سنجش های qPCR تشخیصی که به گنجاندن کنترل های تقویت داخلی متکی هستند، ضروری است (یانگ و روتمن، ۲۰۰۴؛ کوبیستا و همکاران، ۲۰۰۶؛ بوستین و همکاران، ۲۰۰۹).

سنجش qPCR نه تنها برای تشخیص، بلکه برای تعیین حضور ژن‌ها و آلل‌های خاص. به‌عنوان مثال، نوع‌بندی سویه‌ها و ایزوله‌ها، پروفایل مقاومت ضد میکروبی، تولید سم و غیره استفاده می‌شود، با این حال، صرف حضور ژن‌های مسئول مقاومت به ترکیبات ضد میکروبی یا تولید سم قارچی به طور خودکار به معنای بیان یا تولید آنها نیست. بنابراین، اگرچه آزمایش‌های رونوشت مبتنی بر qPCR سریع‌تر هستند، نتایج آنها باید با آزمایش‌های فنوتیپی و بیوشیمیایی مرتبط باشد (لوین، ۲۰۱۲؛ Osei Sekyere و همکاران، ۲۰۱۵).

در مورد تشخیص میکروبی، ملاحظات مختلفی در تشخیص و تعیین کمیت عوامل ویروسی، باکتریایی و انگلی وجود دارد. این ملاحظات بر اساس هدف (DNA یا RNA)، قابلیت کشت، تفسیر نتایج، و اهمیت بالینی نتایج qPCR است.

qPCR نقش مهمی در تشخیص، تعیین کمیت و تایپینگ پاتوژن های ویروسی ایفا می کند. این به این دلیل است که تشخیص ویروس‌های مهم بالینی و دامپزشکی با استفاده از روش‌های کشت زمان‌بر یا غیرممکن است، در حالی که آزمایش‌های ELISA به طور جهانی در دسترس نیستند و از حساسیت و ویژگی نسبتاً پایینی رنج می‌برند. qPCR (با گنجاندن رونویسی معکوس برای تشخیص ویروس‌های RNA) حساسیت و ویژگی مناسب را فراهم می‌کند (Hoffmann et al., 2009). علاوه بر این، تعیین بار ویروسی توسط (RT) -qPCR به عنوان شاخصی برای پاسخ به درمان های ضد ویروسی استفاده می شود (واتزینگر و همکاران، ۲۰۰۶). به این دلایل (RT)-qPCR به یک ابزار ضروری در تشخیص ویروس تبدیل شده است (Yang and Rothman, 2004).

وضعیت در مورد تشخیص تک یاخته های روده ای مشابه است (Rijsman et al., 2016). روش استاندارد طلایی برای تشخیص عوامل تک یاخته‌ای، بررسی میکروسکوپی مدفوع، پرزحمت، زمان‌بر است و به پرسنل آموزش دیده خاص نیاز دارد. به طور مشابه، تست الایزا از حساسیت و ویژگی کم رنج می برد (Rijsman et al., 2016). بنابراین، qPCR در حال حاضر به عنوان یک ابزار قدرتمند در تشخیص، کمی کردن و تایپ کردن تک یاخته‌های انگلی روده در حال ظهور است.

برخلاف تشخیص و تعیین کمیت ویروسی و تک یاخته ای، بسیاری از باکتری ها با اهمیت بالینی، دامپزشکی و ایمنی مواد غذایی را می توان کشت داد. به همین دلیل، کشت به عنوان استاندارد طلایی در تشخیص و کمی سازی باکتری در نظر گرفته می شود. اما در مواردی که نیاز به مداخله حیاتی و به موقع برای بیماری عفونی است، روش‌های کشت سنتی، آهسته و چند مرحله‌ای نمی‌توانند در زمان معقول نتیجه‌ای را ارائه دهند. این محدودیت با نیاز به کشت پاتوژن های سخت گیر و آزمایش های اضافی (تعیین گونه، شناسایی فاکتورهای حدت و مقاومت ضد میکروبی) تشدید می شود. qPCR قادر به ارائه اطلاعات مورد نیاز در زمان کوتاه است. با این حال، ویژگی های فنوتیپی و بیوشیمیایی باید از ایزوله های باکتریایی تایید شود (یانگ و روتمن، ۲۰۰۴).

در ایمنی مواد غذایی، تمام استانداردهای بین المللی برای کیفیت غذا متکی بر تعیین میکروارگانیسم های بیماری زا با استفاده از روش های کشت سنتی است. تکنیک‌های qPCR یک جایگزین عالی برای روش‌های کشت استاندارد موجود است، زیرا آنها تشخیص و کمیت قابل اعتماد (برای چندین پاتوژن) را امکان‌پذیر می‌سازند و مزایای بسیاری دیگر را همانطور که در بالا مورد بحث قرار گرفت، دارند. با این حال، محدودیت‌هایی با توجه به حساسیت سنجش‌های مبتنی بر qPCR وجود دارد. از آنجایی که روش‌های کشت بر تکثیر باکتری‌ها در طی مراحل قبل از کشت (پیش غنی‌سازی) متکی هستند، نمونه‌های جداسازی DNA معمولاً در ابتدا حاوی تعداد بسیار کمی از باکتری‌های هدف هستند. این محدودیت منجر به مهمترین نقطه ضعف qPCR می شود که ناتوانی ذاتی آن در تشخیص سلول های زنده و مرده است. بنابراین، استفاده از qPCR به خود محدود به تایپینگ گونه‌های باکتریایی، شناسایی مقاومت ضد میکروبی، تشخیص و احتمالاً تعیین کمیت در مواد غذایی غیرفرآوری‌شده و خام است. توجه به این نکته مهم است که غذای فرآوری شده همچنان می‌تواند حاوی DNA قابل تقویت باشد، حتی اگر تمام باکتری‌های بالقوه بیماری‌زا در غذا از بین رفته باشند و مواد غذایی از نظر میکروبیولوژیکی برای مصرف بی‌خطر باشند (رودریگز-لازارو و همکاران، ۲۰۱۳). برای غلبه بر این مشکل، یک نمونه از قبل غنی‌سازی شده در محیط کشت می‌تواند قبل از qPCR قرار گیرد. این مرحله ممکن است شامل غنی‌سازی غیرانتخابی در آب پپتون بافر یا محیط‌های انتخابی خاص برای باکتری مربوطه باشد. این روش در درجه اول برای اجازه دادن به احیا/بازیابی و تکثیر بعدی باکتری ها برای تشخیص qPCR پایین دست در نظر گرفته شده است. مزیت دوم رقیق سازی و حذف مهارکننده های احتمالی PCR موجود در نمونه (وجود نمک ها، مواد حفاظتی و غیره) است. استخراج DNA از محیط کشت آسان تر از نمونه های غذایی است که از نظر ترکیب بسیار ناهمگن هستند (مارگوت و همکاران، ۲۰۱۵).

اگرچه qPCR خود نمی تواند بین سلول های زنده و مرده تمایز قائل شود، تلاش هایی برای انطباق qPCR برای تشخیص زنده ماندن انجام شده است. نشان داده شد که RNA پایداری پایینی دارد و باید در عرض چند دقیقه در سلول‌های مرده تجزیه شود. با این حال، همبستگی زنده ماندن سلول با ماندگاری گونه‌های اسید نوکلئیک باید برای یک موقعیت خاص به خوبی مشخص شود قبل از اینکه یک روش تحلیلی مبتنی بر تقویت مناسب به عنوان جایگزینی برای تکنیک‌های کشت سنتی‌ استفاده شود (Birch et al., 2001). علاوه بر این، مشکلات مربوط به جداسازی RNA از نمونه‌هایی مانند غذا، مدفوع یا نمونه‌های محیطی می‌تواند نتایج منفی کاذب را به خصوص زمانی که تعداد کمی از سلول‌های هدف مورد انتظار باشد، ارائه دهد.

گزینه دیگری برای تعیین زنده ماندن با استفاده از qPCR، از طریق رنگ‌های فلورسنت درگیر مانند پروپیدیوم مونوآزید (PMA) و اتیدیوم مونوازید است (EMA؛ Nocker و Camper، ۲۰۰۹). در این روش ها، معیار تعیین زنده ماندن، یکپارچگی غشا است. سلول‌های فعال متابولیک (صرف نظر از قابلیت کشت) با یکپارچگی غشایی کامل، رنگ‌ها را خارج از سلول‌ها نگه می‌دارند و بنابراین به عنوان زنده در نظر گرفته می‌شوند. با این حال، اگر یکپارچگی غشای پلاسما به خطر بیفتد، رنگ ها به سلول ها نفوذ می کنند یا با DNA خارج از سلول های مرده واکنش می دهند. DNA نشان‌دار شده برای تکثیر با qPCR در دسترس نیست و تفاوت بین سلول‌های تیمار شده و تیمار نشده اطلاعاتی درباره نسبت سلول‌های زنده در نمونه فراهم می‌کند. محدودیت این روش، ضرورت وجود سلول‌ها در یک شبکه شفاف از نور، به عنوان مثال، نمونه‌های آب، کشت سلولی و غیره است، زیرا تداخل رنگ با DNA مستلزم قرار گرفتن در معرض نور است. بنابراین، نمونه هایی با شفافیت نوری ناکافی اجازه استفاده از این رنگ ها را نمی دهند. ترجیح PMA بر EMA وجود دارد، زیرا نشان داده شد که EMA به غشای سلول های باکتریایی زنده نفوذ می کند (Nocker et al., 2006).

علاوه بر این، موضوع دیگری که می خواهیم در اینجا به آن اشاره کنیم، تولید و استفاده از استانداردهای مورد نیاز برای منحنی های کالیبراسیون است. به طور کلی، دو رویکرد منتشر شده برای تولید منحنی های کالیبراسیون هستند. یکی از رقت های اسید نوکلئیک ژنومیک هدف و دیگری استانداردهای پلاسمید (عنصر وراثتی غیرفام‏ تنیِ موجود در میان‏یاختۀ باکتری ها) استفاده می کند. هر دو استراتژی می توانند به تعیین کمیت نهایی هدف منجر شوند، اما پلاسمیدهای حاوی توالی هدف خاص، مزایای تولید آسان، پایداری و ارزانی را ارائه می دهند. از طرف دیگر، اصولاً، بازده PCR به‌دست‌آمده با استانداردهای پلاسمید گاهی می‌تواند در مقایسه با بازده به‌دست‌آمده با استفاده از استاندارد ژنومی متفاوت باشد، که در عوض، برای ارگانیسم‌های مقاوم به رشد، تنها با شروع از یک ماتریس مشخص می‌توان جداسازی کرد و در نتیجه مستعد تخریب و تلفات بود.(Chaouachi و همکاران، ۲۰۱۳). در نهایت، تولید و اعتبارسنجی استانداردهای بین‌المللی کمی برای سنجش‌های qPCR از نظر فنی بسیار سخت است و این استانداردها در حال حاضر فقط برای چند هدف در دسترس هستند (Pavšič و همکاران، ۲۰۱۵).

 

 

جهت خرید real time PCR با ما تماس بگیرید

 

پارامترهای qPCR در تشخیص و کمیت میکروبی

 

ویژگی تحلیلی (Selectivity)

این پارامتر در qPCR به ویژگی پرایمرها برای هدف مورد نظر اشاره دارد. ویژگی تحلیلی از دو مفهوم تشکیل شده است:  توانایی روش را برای فراگیری تشخیص طیف گسترده ای از اهداف با ارتباط تعریف شده به عنوان مثال، ترکیب طبقه بندی، ایمونولوژیک، ژنتیکی توصیف می کند. (Anonymous، ۲۰۰۹، ۲۰۱۵a). تعریف فراگیر دیگری را به‌عنوان سویه‌ها یا جدایه‌های آنالیت هدفی که روش می‌تواند تشخیص دهد، توصیف می‌کند (Anonymous، ۲۰۱۲). ISO 16140 و سایر استانداردها توصیه می کنند که فراگیر بودن باید روی ۲۰ تا ۵۰ سویه کاملاً تعریف شده (گواهی شده) ارگانیسم هدف تعیین شود (Anonymous, 2009, 2011, 2012, 2015a; Broeders et al., 2014) یا برای سالمونلا (نوعی باکتری مضرر)، توصیه می شود که ۱۰۰ سرووار (تنوعی واضح در یک گونه از باکتری یا ویروس و یا در میان سلول های ایمنی افراد مختلف) برای تست فراگیر اضافه شود (Anonymous, 2012).

 

حساسیت تحلیلی (محدودیت تشخیص، LOD)

بسیاری از اسناد رسمی تئوری ها و روش هایی را در راستای تعریف صحیح LOD برای روش های مختلف مورد بحث قرار داده اند. یک اجماع کلی در مورد تعریف LOD به عنوان کمترین مقدار آنالیت حاصل شد، که می‌توان آن را با بیش از درصد مشخصی از اطمینان اعلام شده تشخیص داد، اما لزوماً به عنوان مقدار دقیق کمی سازی نمی‌شود(Anonymous، ۲۰۱۱، ۲۰۱۳، ۲۰۱۴).در این راستا، سطح اطمینان به‌دست‌آمده یا درخواست شده برای تعریف LOD می‌تواند منعکس‌کننده تعداد تکرار (هم فنی و هم تجربی) مورد نیاز سنجش برای رسیدن به سطح اطمینان درخواستی (به عنوان مثال، ۹۵٪) باشد.واضح است که هرچه آزمون ها بیشتر تکرار شوند، فاصله اطمینان باریکتر خواهد بود. تعریف دیگری LOD را به عنوان پایین ترین سطح غلظتی که می تواند از نظر آماری متفاوت از یک شاهد در سطح مشخصی از اطمینان تعیین شود، توصیف می کند. این مقدار باید از تجزیه و تحلیل نمونه های شاهد و نمونه های مورد بررسی در سطوح نزدیک به LOD مورد انتظار تعیین شود(Anonymous, 2015a). با این حال، باید توجه داشت که تعاریف LOD شرح داده شده در بالا برای روش های شیمیایی گزارش شده است، و برای روش های PCR کاملا مناسب نیستند (Burns and Valdivia, 2008). دلیل آن این است که، برای غلظت های محدود آنالیت (اسیدهای نوکلئیک)، خروجی واکنش می تواند موفقیت آمیز (تقویت) یا شکست (اصلاً بدون تقویت) باشد، بدون هیچ سطح خالی یا بحرانی که در آن می توان یک مقدار جدا شده تعیین کرد که نمونه می تواند مثبت در نظر گرفته شود. علاوه بر این، در اینجا باید به خاطر داشت که طبق تعریف، یک نمونه کلی (شاهد) هرگز نباید در PCR مثبت باشد.

از آنجایی که تعاریف گزارش شده در بالا برای PCR قابل اجرا نیستند، رویکردهای دیگری پیشنهاد شده است. یک رویکرد محافظه کارانه در نظر گرفتن مقدار LOD به عنوان حداقل غلظت اسید نوکلئیک یا تعداد سلولی است که همیشه یک نتیجه PCR مثبت در تمام تکرارهای آزمایش شده یا در بخش عمده (بیش از ۹۵٪) آنها می دهد (Nutz et al. ، ۲۰۱۱). در عمل، مقادیر متعددی از یک ماتریکس خاص با رقت‌های زنجیره‌ای ارگانیسم هدف مشخص می‌شوند و تحت کل فرآیند جداسازی اسید نوکلئیک و qPCR قرار می‌گیرند. LOD سپس به عنوان مقدار سنبله ارگانیسم هدف در رقت تعریف می شود که می تواند در ۹۵٪ از تکرارها شناسایی شود. به عنوان مثال، ۱۰ تکرار از نمونه‌های شیر با رقت‌های سریالی کمپیلوباکتر ژژونی در مقادیر ۱۰۰-۱۰۵ سلول در هر ۱ میلی‌لیتر شیر اسپایک شدند. LOD تعیین شده تجربی روش برای تشخیص C. jejuni در شیر تقریباً ۱٫۵۶ × ۱۰۳ سلول در میلی لیتر شیر است (شکل ۲). به منظور تعریف بهتر دقیق‌ترین مقدار، می‌توان رقت‌های بیشتری را قبل از رسیدن به مقدار LOD نهایی تا حد امکان نزدیک به واقعی آزمایش کرد. تعداد تکرارهای آزمایش شده باید حداقل شش باشد (Slana et al., 2008; Kralik et al., 2011). با این حال، هرچه تکرارهای بیشتری (۱۰ یا ۱۵ و بیشتر؛ ریچی و همکاران، ۲۰۱۶) انجام شود، سطح اطمینان بالاتری از LOD قابل دستیابی است (Anonymous, 2015b).

 

با توجه به توزیع پواسون، نتیجه گیری شد که LOD برای PCR نمی تواند کمتر از حداقل سه نسخه از اهداف اسید نوکلئیک باشد (Bustin et al., 2009; Johnson et al., 2013). با این حال، این مقدار به LOD نظری روش qPCR اشاره دارد که قادر به تشخیص یک مولکول DNA هدف واحد در نمونه است. با فرض این، چنین LOD برای تمام سنجش های qPCR بهینه شده مشابه خواهد بود. بنابراین، همانطور که در بالا گفته شد، LOD باید به کل روشی که شامل تهیه اسید نوکلئیک و qPCR است مربوط باشد. فقط تحت این شرایط می تواند یک پارامتر معتبر را نشان دهد که ویژگی های روش qPCR مربوطه را توصیف می کند (Anonymous, 2015a).

با این حال، گاهی اوقات به دلایل مالی و فنی امکان دستیابی به تعداد زیادی تکرار وجود ندارد. برای غلبه بر این مشکلات، تعداد فزاینده‌ای از گزارش‌ها از رویکردهای Probit یا Logit برای تعیین LOD برای روش‌های PCR استفاده می‌کنند (Burns و Valdivia، ۲۰۰۸؛ Anonymous، ۲۰۱۴؛ Pavšic و همکاران، ۲۰۱۶؛ Ricchi و همکاران، ۲۰۱۶). به طور خلاصه، هر دو تابع ریاضی رگرسیون هایی هستند که برای تجزیه و تحلیل متغیرهای پاسخ دوجمله ای (مثبت یا منفی) استفاده می شوند و می توانند منحنی دوز-پاسخ سیگموئیدی را که معمولی یک متغیر دو جمله ای است، به یک خط مستقیم تبدیل کنند که سپس می تواند با رگرسیون از طریق حداقل تجزیه و تحلیل شود. مربع یا روش های حداکثر احتمال نقطه پایانی نهایی تجزیه و تحلیل یک غلظت (همراه با فواصل نسبی اطمینان) است که با احتمال (مثلاً ۹۵٪) برای تشخیص اسید نوکلئیک مرتبط است. علاوه بر این، رگرسیون Probit فقط برای داده های توزیع شده عادی قابل بهره برداری است، در حالی که تابع Logit می تواند برای داده هایی که به طور معمول توزیع نشده اند نیز استفاده شود. با این حال، در این زمینه، هر دو تابع به یک معنی است.

در نهایت، باید توجه داشت که LOD یک مقدار محدود کننده نیست و بنابراین، مقادیر Cq کمتر از LOD را نمی توان به طور خودکار منفی در نظر گرفت. از تعریف LOD، مشهود است که مقادیر کمتر از LOD از نظر حضور میکروارگانیسم کاملا معتبر هستند. با این حال، احتمال تشخیص مکرر آنها کمتر از ۹۵٪ است. این ویژگی هنگام کار با اعداد کوچک به توزیع پواسون مرتبط است.

 

محدوده کمی (LOQ) Limit of Quantification

اسنادی که قبلاً برای تعاریف LOD ذکر شده اند همچنین شامل تعاریف آنالوگ برای LOQ هستند. LOQ به عنوان کوچکترین مقدار آنالیت تعریف شده است که می توان آن را با دقت و صحت تعریف شده در شرایط تجربی با روش در حال اعتبارسنجی اندازه گیری و کمی کرد (Armbruster و Pry، ۲۰۰۸؛ Anonymous، ۲۰۱۱، ۲۰۱۳). یک تعریف جایگزین این است که LOQ کمترین مقدار یا غلظت آنالیت است که می تواند به صورت کمی با سطح قابل قبولی از عدم قطعیت تعیین شود (Anonymous, 2015a). واضح است که طبق تعاریف قبلی، LOQ هرگز نمی تواند کمتر از LOD باشد.

در عمل، LOQ مانند LOD، روی نمونه‌های مشخص شده تعیین می‌شود، اما ارزیابی نتایج کمی است. از نظر عددی، LOQ به عنوان پایین‌ترین غلظت آنالیت تعریف می‌شود، که یک تغییرپذیری از پیش تعریف‌شده را می‌دهد، که عموماً به عنوان ضریب تغییرات (CV) گزارش می‌شود. برای qPCR، این مقدار پیشنهاد شده است که کمتر از ۲۵٪ ثابت شود (Broeders et al., 2014; Dreo et al., 2014; Anonymous, 2015b; Pavšic et al., 2016) با در نظر گرفتن این نکته که مقادیر Cq باید قبل از ارزیابی CV مجدداً به کپی یا گرم از اسیدهای نوکلئیک محاسبه شود. (Bustin et al., 2009; Johnson et al., 2013). هوورر، این مقدار بر اساس تجربه به دست آمده در آزمایشگاه‌های تشخیص GMO پیشنهاد شد (Broeders et al., 2014; Anonymous, 2015b)، و هیچ توافق کلی در مورد هیچ استاندارد فنی برای روش‌های مولکولی در میکروبیولوژی وجود ندارد. بنابراین، در اینجا پیشنهاد می‌کنیم که LOQ را در تشخیص مولکولی میکروارگانیسم‌ها به عنوان کمترین غلظت، مقدار یا تعداد آنالیت‌ها با CV کمتر از ۲۵% تعریف کنیم.

رویکرد دیگر برای تعیین LOQ qPCR مبتنی بر استفاده از شاخص یودن (J) و منحنی‌های مشخصه عملکرد گیرنده است (Nutz و همکاران، ۲۰۱۱). این آخرین شاخص به عنوان J = حساسیت + ویژگی -۱ ((J = sensitivity + specificity −۱)) تعریف شد (Fluss et al., 2005). مجموعه‌ای از نمونه‌های مشخص شده با غلظت‌های مختلف DNA هدف آنالیز شد و مقادیر J برای هر چرخه PCR محاسبه شد. سپس LOQ به عنوان غلظت DNA که در آن مقادیر J بالاترین بود، ثابت شد (Nutz و همکاران، ۲۰۱۱).

در نهایت، موضوعی که باید برای تعیین LOQ و همچنین LOD مورد توجه قرار گیرد، کارایی بازیابی مولکول‌های هدف در طول مراحل استخراج اسید نوکلئیک است. به طور کلی، اسیدهای نوکلئیک از ماتریس های پیچیده مختلف مانند غذا، مدفوع یا نمونه های دیگر با روش های مختلف استخراج می شوند. راندمان بازیابی DNA معمولاً حدود ۳۰ درصد و کمتر است (سلانا و همکاران، ۲۰۰۸؛ کرالیک و همکاران، ۲۰۱۱؛ ​​ریچی و همکاران، ۲۰۱۶) و نادیده گرفتن این پارامتر منجر به دست کم گرفتن تعداد واقعی میکروارگانیسم های هدف می شود. نمونه اصلی، که سپس با مقادیر پایین LOD و LOQ منعکس می شود. بنابراین، تعیین کارایی جداسازی DNA باید بخشی از LOD و LOQ باشد. بازده جداسازی DNA ضریبی است بین تعداد میکروارگانیسم‌های بازیابی شده پس از کل فرآیند (استخراج اسید نوکلئیک + qPCR) و تعداد میکروارگانیسم‌هایی که برای اسپایک کردن ماتریس‌های منفی استفاده می‌شوند (Slana و همکاران، ۲۰۰۸؛ کرالیک و همکاران، ۲۰۱۱؛ ​​Ricchi). و همکاران، ۲۰۱۶). با توجه به اینکه این داده ها در هنگام تعیین LOD و LOQ ارائه می شوند، نیازی به انجام آزمایش های اضافی نیست. توصیه می شود که میانه مقادیر میانگین جداسازی DNA از رقت های مختلف به عنوان کارایی عملی جداسازی DNA استفاده شود (Kralik et al., 2011).

مشابه LOD، کمیت را نیز می توان در نمونه هایی با تعداد ارگانیسم ها یا غلظت DNA کمتر از LOQ ارزیابی کرد، اما اطمینان چنین کمی سازی کمتر از آن چیزی است که در تعریف LOQ اعلام شده است. علاوه بر این، این امکان وجود دارد که چگونه می توان به چنین مقادیری از نظر تفسیر نیمه کمی اشاره کرد، به عنوان مثال، محدوده مقادیر (۱۰۲-۱۰۱ سلول در گرم).

 

توسعه بهره‌وری  qPCR (E)

این پارامتر در بالا در بخش مربوط به توصیف ریاضی qPCR (معادله ۴) ذکر شد. بازده PCR باید در محدوده ۰-۱ (۰-۱۰۰%) باشد. هنگامی که E = 1 این بدان معناست که تعداد آمپلیکون های DNA تازه تشکیل شده در هر چرخه دو برابر می شود. در طول زمان به سختی می توان به این موضوع پی برد. در عمل، این پارامتر احتمالاً در محدوده ۹۰ تا ۱۰۵٪ قرار دارد (جانسون و همکاران، ۲۰۱۳). این پارامتر را می توان از شیب منحنی کالیبراسیون تخمین زد.

در ارتباط با این موضوع، کمترین و بالاترین غلظت استاندارد موجود در منحنی کالیبراسیون، که می‌تواند واقعاً کمی باشد، باید با توجه به محدوده دینامیکی خطی بیش از حداقل شش log10 تعیین شود. محدوده دینامیکی توسط دستورالعمل های MIQE به عنوان محدوده ای که یک واکنش در آن خطی است تعریف می شود (Bustin et al., 2009).

تعیین بازده PCR توسط منحنی استاندارد در واقع دو اطلاعات را ارائه می دهد. اگر یک بازدارنده در غلیظ ترین نمونه وجود داشته باشد، افزایش قابل مشاهده ای در مقادیر Cq در این نمونه ها وجود خواهد داشت و بنابراین در غلظت های بالاتر دهانه ۳٫۳۲۲ Cq کاهش می یابد. با این حال، این یک پدیده مکرر نیست، زیرا استانداردها معمولاً به خوبی مشخص می شوند و بنابراین، هر گونه بازداری نسبتاً بعید است. اگر وضعیت مشابهی در نمونه‌های با غلظت پایین‌تر وجود داشته باشد، به جای وجود بازدارنده‌ها، احتمال خطای پیپ‌تینگ وجود دارد. یک تابع مهم برای ارزیابی این ضریب تعیین (مقدار R2) است که باید بالاتر از ۰٫۹۸ باشد (جانسون و همکاران، ۲۰۱۳). در واقع، تعیین مهار PCR و کاهش متعاقب آن راندمان PCR در نمونه‌های آنالیز شده بسیار مهم‌ است. رویکردهایی بر اساس تجزیه و تحلیل منحنی فلورسنت هر نمونه توسط نرم افزار خاص (LinRegPCR) وجود دارد که می تواند کارایی PCR هر نمونه را بدون سری رقت ها محاسبه کند. با این حال، این رویکرد بی عیب و نقص نیست زیرا همه متغیرهای ممکنی را که می توانند بر تحلیل تاثیر بگذارند در نظر نمی گیرد (Ruijter et al., 2009).

 

نتیجه

فناوری qPCR یک ابزار قدرتمند در تشخیص میکروبی است. در تشخیص ویروسی و انگلی، کمی سازی و تایپینگ کردن، مناسب بودن این تکنیک بدون شک است. در زمینه تشخیص باکتریایی می تواند جایگزین روش های کشت شود، به خصوص زمانی که به سنجش های تشخیصی سریع و حساس نیاز باشد. گسترش qPCR به بخش های مختلف تشخیص معمول میکروبی همراه با فقدان رویه های استاندارد برای تعیین پارامترهای عملکردی اساسی qPCR منجر به سناریویی شده است که در آن استانداردسازی روش ها بر اساس قوانین مختلف توسط آزمایشگاه های مختلف انجام می شود. این مسئله تا حدی با انتشار دستورالعمل های MIQE حل شد (Bustin et al., 2009). با این حال، تفاوت‌هایی در نگرش به اعتبارسنجی و استانداردسازی سنجش‌های qPCR در مناطق بالینی، دامپزشکی و ایمنی مواد غذایی وجود دارد. هر کمکی به یکسان سازی روش های استانداردسازی و اعتبار سنجی، کیفیت سنجش های qPCR در تشخیص، کمی سازی و تایپ میکروبی را بهبود می بخشد.

 

 

منبع

جهت مشاهده محصول مرتبط اینجا کلیک کنید

 

 

جهت استعلام قیمت PCR real-time با ما تماس بگیرید